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2019年08期
作者:叶侃，魏兆军胡飞*单位:合肥工业大学生物与食品科学技术学院
简介:叶侃，安徽合肥人，硕士研究生，研究兴趣:生物化学和分子生物学。*通讯作者、教授、博士生导师，从事农林专业功能性食品加工及真核功能基因表达调控研究。
基金项目:国家自然科学基金项目(31301657)。
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米象属于鞘翅目象甲科，是一种完全异常的昆虫。它有卵、幼虫、蛹和成虫四种发育形式，是储粮的主要害虫之一。成虫在外面吃谷物颗粒，而幼虫寄生在谷物内部吃。由于其在世界各地的地理分布和快速的生长繁殖，对储粮造成了严重的危害。在我国，米象主要生长在南方。
真核生物具有谷胱甘肽硫转移酶的各种催化活性，以适应广泛的酶家族功能。生物体有一套复杂的防御系统来抵御外来和内源性有害物质。在这个系统中，GsT起着非常重要的作用。它经常在极端条件下发挥抗氧化和解毒作用，从而保护生物体。研究GSTs与抗药性的关系对储粮害虫的防治具有重要的理论和现实意义。
作者分析了稻象甲代谢解毒相关基因谷胱甘肽硫转移酶的表达，获得了稻象甲基因的遗传信息，从本质上全面揭示了稻象甲对磷化氢的抗性。
1材料和方法
1.1
昆虫治疗
待测昆虫:
实验中使用的不同昆虫状态(卵、幼虫、蛹和成虫)的水稻影像资料来自河南工业大学农产品贮藏实验室。
磷化氢气体的制备:
磷化氢气体是通过磷化铝与10%稀硫酸反应制备的。磷化氢浓度用钼蓝比色法测定。用密封注射器将磷化氢注入装有测试昆虫的特殊true 空干燥器中。
阻力测定:
采用粮农组织方法熏蒸20小时(25℃，相对湿度70%)。将处理过的试验昆虫从干燥器中取出，放在昆虫饲养室中14天，以检查死亡状态并计算死亡率。
稻象的应激处理:
不同浓度磷化氢处理和不同熏蒸时间处理。
数据处理:
用SPSS软件进行分析和统计。
1.2
水稻象转录组分析
每个测试样品通过sorexaRNA的成对末端测序法进行测序，最短的阅读片段从零开始组装到转录组中。将获得的单基因与数据库中编码已知功能蛋白的基因序列进行比较，并鉴定GsT、细胞色素P450和EST基因。
1.3
RACE反应获得水稻大象代谢解毒基因全长
设计种族引物:
根据上一步获得的稻象甲代谢解毒基因的中间片段，分别设计5’RACE和3’RACE特异性引物，扩增5’端和3’端的全长序列，并预测长度。
5’-RACE和3’-RACE就绪型cDNA模板的合成:
为了获得RACE就绪型cDNA模板并制备3’-RACE就绪型cDNA合成反应体系，需要两个反应管，每个反应管为10μL的反应体系。
线粒体代谢解毒基因5'RACE和3'RACE的扩增:
以稻象甲代谢解毒基因3’-RACE-Ready和5’-RACE-Ready分别为模板，用高保真酶扩增设计的PR3 F1和PR5-R1引物和通用引物UPM。
序列拼接:
5’-RACE和3’-RACE测序后，在NCBI数据库中进行序列比对，并用DNAMAN软件拼接序列，找到起始密码子ATG和终止密码子TAA。在起始密码子和终止密码子分别设计特异性引物，扩增稻象甲代谢解毒基因序列的全长。凝胶切割恢复后，将稻象甲代谢解毒基因序列连接到pGEM-T简易载体载体载体上，转化后选择阳性克隆测序。
米象代谢解毒的全长序列分析:
利用引物5.0和DNAMAN软件分析了稻象甲的13个GST基因序列，并根据其他报道基因序列的结构特征分析了稻象甲的代谢解毒基因。
水稻象代谢解毒基因进化树的构建:
利用MEGA构建系统进化树，系统进化树是根据不同物种的GST、P450和EST序列构建的。
1.4
米象代谢解毒基因的定量表达
核糖核酸提取是预先处理的:
在冰上解剖不同熏蒸浓度和熏蒸时间的稻象甲，解剖发育不同阶段的稻象甲分别为一龄、二龄、三龄和四龄幼虫、蛹和成虫。解剖米象的不同组织:头部、表皮、中肠、脂肪体和马氏管。每个样品等量提取三次，每个样品包括五个个体，核糖核酸提取步骤与以前相同。
引物设计和引物质量鉴定:
设计荧光定量聚合酶链反应引物，对4种样品进行荧光定量聚合酶链反应，检测这些基因的表达。
荧光定量聚合酶链反应:
用荧光染料SYBR预混Ex Taqⅱⅱ制备了20μL的反应体系。将样品加入96孔板中，在生物荧光双色实时聚合酶链反应检测系统荧光定量聚合酶链反应仪上进行荧光定量聚合酶链反应。
2
结果和分析
2.1
水稻象谷胱甘肽转移酶基因的分离与鉴定
通过克隆获得了13个稻象甲GSTs基因全长序列，具体信息见表1。水稻象GSTs基因序列的总长度为811-1209 BP，估计编码氨基酸为202-239，分子量为23.19~27.63kD，理论等电点为5.30-8.71。
根据序列相似性和进化关系，6个基因被划分为ε家族(GSTe1、GSTe3、GSTe4、GSTe5、GSTe7、GSTe8)，4个基因被划分为Sigma家族(GSTs1、GSTs3、gstss4、gss5)，2个基因被划分为θ家族(GsTe 1、GsTe 2)，1个基因被划分为δ家族(gst1)(表2)。ε家族基因之间的氨基酸相似度为33.5%~56.0%，σ家族基因之间的氨基酸相似度为44.7%~70.3%，θ家族基因之间的氨基酸相似度为22.2%。
2.2水稻象GSTs基因的表达模式
从图1中可以看出，用不同浓度(LC50、LC30、LC10)的磷化氢熏蒸24小时后，SoGSTd1、SoGSTe1和SoGSTe5基因的相对表达水平没有显著差异。LC30磷化氢熏蒸24h后，SoGSTe2和SogsTe 1基因的相对表达显著高于其他两种浓度。LC50浓度磷化氢熏蒸24h后，四个GSTs基因(SoGSTe3、SoGSTe4、sogsst1和sogsst2)的相对表达显著高于对照组、LC30和LC10处理组。用任何浓度磷化氢熏蒸24h后，SoGSTe6、SogsTe 3和SogsTe 2基因的相对表达明显低于对照组。
随着熏蒸时间的增加，8个GSTs基因(SoGSTd1、SoGSTe2、SoGSTe3、SoGSTe4、SoGSTe5、SoGSTs1、SogstS 4和sogst2)的相对表达逐渐增加。熏蒸36小时后，相对表达最高，然后开始下降。LC30磷化氢熏蒸48h后，SoGSTe1基因的相对表达达到最大。磷化氢熏蒸LC30 12h后，SoGSTs2和SoGSTt1基因的相对表达达到最大，然后开始逐渐降低。然而，磷化氢熏蒸后不同时间SoGSTs3基因的相对表达明显低于对照组(图1)。
磷化氢诱导米象13个GSTs基因的剂量和时间效应如图2所示，在稻象甲西格玛家族的GSTs基因中，成虫期SoGSTs1、SoGSTs2和SoGSTs4基因的相对表达高于其他5个发育阶段。SoGSTs3基因的相对表达在4龄幼虫最高，在蛹期最低。
SoGSTt1基因在蛹期和4龄幼虫期的相对表达高于其他4个发育阶段。SoGSTt2基因在成虫和蛹阶段的相对表达高于其他4个发育阶段。
图2米象不同发育阶段13个GSTs基因的相对表达模式如图3所示，13个GSTs基因中的11个(sogsstd1、SoGSTe1、SoGSTe2、SoGSTe3、SoGSTe4、SoGSTe5、SoGSTe6、sogssts1、SoGSTs2、Sogsts 3、Sogsts 4)在中肠、脂肪体或马氏管中的相对表达显著高于在头和表皮中的相对表达。SoGSTe6、sogst2和sogst2基因在表皮中的相对表达最低。稻象甲五个组织部位SoGSTt1基因的相对表达无显著差异。
图3米象不同组织中13个GSTs基因的相对表达模式3
结论和讨论
克隆了13个稻象甲GsT基因全长序列。这些基因中有6个属于ε家族，4个属于西格玛家族，2个属于θ家族，1个属于德尔塔家族。在米象GSTs基因中没有发现欧米茄、泽塔和未分类的基因。
用不同浓度和不同时间的磷化氢熏蒸水稻象敏感品系。一般来说，GSTs的表达水平受熏蒸时间和剂量的影响，并与时间和剂量呈正相关。总的来说，GSTs的表达随着稻象甲的生长发育而逐渐增加。
米象中肠、脂肪组织或马氏管中11个GSTs基因的相对表达显著高于头部和表皮。谷硫磷基因在米象成虫期的相对表达最高，其次是4龄幼虫。
该研究不仅揭示了稻象甲进化过程中的遗传关系，而且揭示了稻象甲相关耐药基因的分子机制，进一步解释了拮抗昆虫的原理，为新药的开发提供了指导。同时，稻象甲的遗传信息资源得到了拓展，为进一步研究稻象甲转录组奠定了基础。本研究选择稻象甲中的谷胱甘肽硫转移酶基因进行系统分析。可以认为，抗性基因数据库的建立一方面可以研究昆虫的种间关系，另一方面对全面控制昆虫抗性和维持生态平衡具有积极意义。
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