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2019年02期
作者:丁逸飞、曹春雨、王培清*单位:重庆大学生物工程学院
简介:丁逸飞，四川乐山人，硕士研究生。他的研究方向是分子遗传学。*通讯作者、硕士导师、博士，从事分子生物学和基因工程研究。
基金项目:中国国家自然科学基金总项目(31372287)。
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OSID开放科学项目
动物复杂而精确的生殖发育过程是由中枢神经系统和内分泌系统共同控制的。下丘脑中众多生殖相关神经肽信号汇聚在促性腺激素释放激素神经元上，共同控制下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴中具有各种生殖相关因子的动物的生殖发育过程。三七总皂苷(PNX)是生物信息学技术于2013年发现的一种新的生殖相关肽，广泛表达于下丘脑和外周组织，在下丘脑表达最高。
研究发现三七总皂苷可以通过与受体GPR173结合来调节下丘脑和垂体细胞系中的一些生殖相关基因，并且三七总皂苷被发现参与成年大鼠动情期的调节。然而，在生殖过程中仍有许多未知的调节PNX的机制。
目的构建慢病毒介导的PNX沉默载体，并对GnRH分泌细胞(GT1-7)进行感染和筛选鉴定，获得稳定的PNX沉默细胞系，为在分子和模型动物水平上进一步探索PNX的生殖调控机制奠定基础。
方法
利用RNAi干扰技术构建慢病毒沉默载体，将病毒包装在293T细胞中，并测定滴度。感染促性腺激素释放激素分泌细胞(GT1-7)，筛选嘌呤霉素获得稳定细胞后，用实时聚合酶链反应和蛋白质印迹检测PNX沉默效应。
结果
shPNX和shCON载体的构建及[序列测定/S2/]
在构建shPNX和shCON载体后，它们被送到生物公司测序。经脱氧核糖核酸-人工神经网络软件分析，靶序列成功插入慢病毒载体，载体构建成功。
慢病毒包装和滴度测定
包装后，分别检测shPNX和shCON慢病毒的滴度。shPNX慢病毒滴度为2.2×108 TU/毫升，shCON慢病毒滴度为2.5×108 TU/毫升。
慢病毒感染GT1-7及稳定细胞系的筛选
用shPNX和shCON慢病毒感染GT1-7后，通过嘌呤霉素筛选获得稳定的慢病毒感染细胞系(图1)。
图1慢病毒感染的稳定细胞系的绿色荧光蛋白表达(100倍)三七总皂苷基因表达水平
shPNX组(0.297)的PNX基因表达明显低于shCON组(1.167)和阴性对照组(1.000)，差异有显著性(P & amp；P。lt。0.01).
[蛋白表达水平/S2/][PNX/S2/]
shPNX组蛋白表达明显低于shCON组和阴性对照组(P & amp；P < 0 . 05)。lt。0.01，图2)。
图2 pnx蛋白表达水平结论[/s2/]
慢病毒介导的PNX沉默载体成功构建，包装的慢病毒成功感染GT1-7细胞，实时聚合酶链反应和蛋白质印迹证实了PNX沉默细胞系的PNX沉默效应。
本实验构建的慢病毒介导的三七总皂苷干扰载体和三七总皂苷沉默的三七总皂苷分泌细胞系可进一步用于探索三七总皂苷与三七总皂苷等生殖相关肽的调控关系，也可为进一步探索三七总皂苷在模型动物中的生殖调控及其他生物学功能奠定基础。
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